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월계수 잎의 알코올 추출물과 클로로포름 분획물을 함유하는 허혈성 신경계 뇌질환의 예방 및 치료용 조성[서울대학교산학협력단]
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1. 개요
본 발명은 월계수 잎의 알코올 추출물과 클로로포름 분획물을 함유하는 허혈성 신경계 뇌질환의 예방 및 치료 용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 월계수 알코올 추출물과, 클로로포름 분획물 및 핵산 분획물이 산 소 포도당 결핍 환경에서 유도되는 뇌 세포 사멸에 대한 영향과, 중뇌동맥 폐쇄로 인한 뇌 경색 억제 효과를 도출함으로써 월계수 잎의 알코올 추출물과 클로로포름 분획물이 허혈성 신경계 뇌질환의 예방 및 치료용 조성 물을 제공하는데 있다.
2. 배경 기술
인간의 여러 장기 중 뇌는, 가장 많은 에너지를 소비하는 기관이지만, 스스로는 에너지를 생산하거나 혹은 저 장하지 못하고 혈액 공급에만 전적으로 의존하는 기관이다. 따라서 혈액 공급의 차단은 즉각적인 뇌 조직의 손 상과 뇌 신경 세포의 사멸을 유도한다. 이러한 손상은 뇌 기능의 장애로 이어지기 때문에 각종 허혈성 뇌 관련 질병과 연관성이 있고, 뇌 특정 부위 조직의 손상에 따른 행동장애나 운동장애, 지각장애 등도 동반하여 유발 될 수 있다. 즉, 혈액 공급의 차단으로 인한 뇌 조직의 손상을 효과적으로 예방, 치료함으로써, 이차적으로 발 생 될 수 있는 각종 장애도 완화시킬 수 있다.
특히, 뇌졸중은 크게 뇌 혈관이 협착되거나 혈전에 의해 막힘으로 인하여 혈액 공급이 차단되었을 때 일어나 는 뇌 허혈과 두개 내의 출혈로 인한 뇌 출혈로 나눌 수 있다. 그 중에서 뇌 허혈은 혈액 공급 차단으로 인해 산소와 영양분의 결핍이 일어남으로써 신경세포에서 ATP 감소가 일어나고 부종이 발생하여 직접적인 세포의 손 상 및 괴사를 유도한다. 이러한 부종은 뇌의 원활한 역할을 방해하고 조직의 괴사를 유도하여 광범위한 뇌 조 직 손상을 유도하여 손상 부위에 따른 이차적인 행동 장애나 인지 장애 등을 유발하게 된다. 따라서 대부분의 뇌졸중 환자들은 혈전을 제거한 후에도 뇌 조직 손상에 따른 행동 장애를 가지게 되고, 이 또한 뇌졸중 치료 중 중요한 부분이라고 할 수 있다. 또한, 최근에는 사망원인 1위일 만큼 빈번히 발생하는 질환이다. 현재 뇌 허혈에 대한 치료제는 FDA 의 승인을 받은 t-PA (tissue plasminogen activator)가 있는데, 이것은 혈전 용해 제로써 막혀있는 혈전을 제거하고 빠르게 혈액을 다시 공급해 주는 처치인데, 처치가 발생 3시간 이내에 이루 어 져야 하고, 출혈성 뇌 허혈의 가능성이 동시에 있을 경우는 사용할 수 없는 등의 한계가 있다. 즉, 현재는 궁극적인 허혈에 의한 조직 손상을 치료, 예방하거나 뇌 손상으로 인한 행동장애나 지각장애를 치료 예방하는 의약품은 없다.
월계수는 쌍떡잎 식물 미나리아재비목 녹나무과의 상록 교목으로, 유럽 등지에서 향신료나 관상수로 이용되어 왔다. 이러한 월계수는 항산화 [Simic, M., T. Kundakovic, and N. Kovacevic, Preliminary assay on the antioxidative activity of Laurus nobilis extracts. Fitoterapia, 2003. 74(6): p. 613-6.], 진통, 항염증 [Sayyah, M., et al., Analgesic and anti-inflammatory activity of the leaf essential oil of Laurus nobilis Linn. Phytother Res, 2003. 17(7): p. 733-6.], 항경련 [Sayyah, M., J. Valizadeh, and M. Kamalinejad, Anticonvulsant activity of the leaf essential oil of Laurus nobilis against pentylenetetrazole- and maximal electroshock-induced seizures. Phytomedicine, 2002. 9(3): p. 212-6.]등 에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
산소-포도당 결핍 (OGD) 에 의한 세포 사멸 유도 방법은 실제 뇌 허혈에서 혈액 공급의 차단으로 산소와 영양 분의 결핍에 의한 세포 사멸과 가장 유사한 모델이다 [Goldberg, M.P. and D.W. Choi, Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture: calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury. J Neurosci, 1993. 13(8): p. 3510-24.; Strasser, U. and G. Fischer, Quantitative measurement of neuronal degeneration in organotypic hippocampal cultures after combined oxygen/glucose deprivation. J Neurosci Methods, 1995. 57(2): p. 177-86.]. OGD 방법은 배양한 세포를 인위적으로 포도당이 제거된 배지로 처리하고 95% N2 와 5 % CO2 혼합가스와 함께 밀폐하여 허혈 상태를 유도하고, 다시 포도당과 산 소를 공급해준다.
이때, 세포는 일정시간 허혈의 상태로 괴사 (necrosis) 와 자멸사 (apoptosis) 가 유도되다가, 포도당과 산소 의 재공급 (reoxygantion) 으로 인하여, 급격히 ATP를 생산하게 되어 세포 자멸사가 더욱 빠르게 유도되게 된 다. 이러한 OGD 모델을 인간신경아세포종과 쥐의 대뇌 피질에 직접 적용 하는 것은, in vitro 수준에서 임상학 적 뇌 허혈과 가장 유사한 환경에서 예상 한약재의 효과를 검증하는 방법이라고 할 수 있다 [Siqueira, I.R., et al., Neuroprotective effects of Ptychopetalum olacoides Bentham (Olacaceae) on oxygen and glucose deprivation induced damage in rat hippocampal slices. Life Sci, 2004. 75(15): p. 1897-906.; Croslan, D.R., et al., Neuroprotective effects of neuregulin-1 on B35 neuronal cells following ischemia. Brain Res, 2008. 1210: p. 39-47.]. 특히, 쥐의 대뇌 피질을 이용한 방법은 실제 뇌조직을 이용하므로 실제 세포 손 상과 관련한 세포 내외 분비물들이나 기능들을 효과적으로 재연해주는 장점이 있다. [Taylor, C.P., S.P. Burke, and M.L. Weber, Hippocampal slices: glutamate overflow and cellular damage from ischemia are reduced by sodium-channel blockade. J Neurosci Methods, 1995. 59(1): p. 121-8.].
뇌세포에서 인산화 상태로 존재하다가 자멸사 초기 단계에서 탈인산화 되면서 활성화 되어 자멸사를 유도한다 [Velentza, A.V., et al., An aminopyridazine-based inhibitor of a pro-apoptotic protein kinase attenuates hypoxia-ischemia induced acute brain injury. Bioorg Med Chem Lett, 2003. 13(20): p. 3465-70.]. 그 동안 DAPK 에 대한 연구는 암 관련 연구에서 DAPK 의 활성화로 암세포의 자멸사를 유도하는 것 에 초점이 맞추어져 왔으나, 최근의 연구에서 뇌 허혈 환경인 저산소, 저영양분 상태(OGD) 에서 DAPK가 급격히 활성화 된다는 연구가 있으며, 특히 자멸사에 관련한 다른 단백질들의 인산화에 작용하여 단백질의 기능을 억 제 또는 촉진하여 자멸사를 유도하는 것으로 보고되었다. [Shamloo, M., et al., Death-associated protein kinase is activated by dephosphorylation in response to cerebral ischemia. J Biol Chem, 2005. 280(51): p. 42290-9.; Chen, C.H., et al., Bidirectional signals transduced by DAPK-ERK interaction promote the apoptotic effect of DAPK. EMBO J, 2005. 24(2): p. 294-304.; Eisenberg-Lerner, A. and A. Kimchi, DAP kinase regulates JNK signaling by binding and activating protein kinase D under oxidative stress. Cell Death Differ, 2007. 14(11): p. 1908-15.]. 따라서, DAPK 의 활성을 억제하면 뇌 허혈로 유도되는 세포 사멸 을 억제 할 수 있다.
중뇌동맥은 뇌 허혈 환자들에서 가장 빈번히 허혈이 발생하는 혈관으로써, [0008] 혈액 공급이 차단되면 글루타메이트 수용기가 활성화되고 세포 내 칼슘의 농도가 급격히 증가함으로써 세포 사멸을 유도하게 된다 [Irving, E.A. and M. Bamford, Role of mitogen- and stress-activated kinases in ischemic injury. J Cereb Blood Flow Metab, 2002. 22(6): p. 631-47.; Karadottir, R., et al., NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia. Nature, 2005. 438(7071): p. 1162-6.]. 따라서 쥐의 중뇌동 맥 폐쇄 (middle cerebral artery occlusion ,MCAO) 를 이용한 국소 뇌 허혈 유도 방법은 많은 연구에서 이용 되어왔다 [Longa, E.Z., et al., Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989. 20(1): p. 84-91]. 중뇌동맥 폐쇄법은 수술용 나일론 실을 이용해서 중뇌동맥의 도입부를 막아 줌으로써 혈액의 공급을 차단하고, 다시 실을 제거하여 줌으로써 대뇌피질의 뇌경색 중심부와 경계부에서 각각 신경세포의 분포와 혈류 및 대사적 차이에 의하여 확실하게 뇌경색이 유발되고 신경학적 운동 실조까지 동반된다 [Dirnagl, U., C. Iadecola, and M.A. Moskowitz, Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci, 1999. 22(9): p. 391-7.; Mergenthaler, P., U. Dirnagl, and A. Meisel, Pathophysiology of stroke: lessons from animal models. Metab Brain Dis, 2004. 19(3-4): p. 151-67.; Rodrigues, C.M., et al., Neuroprotection by a bile acid in an acute stroke model in the rat. J Cereb Blood Flow Metab, 2002. 22(4): p. 463-71.].
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 본 발명에서는 월계수 잎의 알코올 추출물과 클로로포름 분획물의 허혈성 신경계 뇌질환의 예방 및 치료의 조성물을 제안하고자 한다.
3. 발명의 설명
특허명:월계수 잎의 알코올 추출물과 클로로포름 분획물을 함유하는 허혈성 신경계 뇌질환의 예방 및 치료용 조성 특허번호:10-1111522-0000
본 발명은 월계수 알코올 추출물과 핵산 분획물은 인간 신경아세포종 SH-SY5Y cell을 OGD 처리한 인위적 뇌 허혈 모델에서 세포 사멸에 대한 보호 효과가 있는데, 월계수 클로로포름 분획물은, 인간 신경아세포종 SH-SY5Y cell 의 뇌 허혈 모델에서, DAPK가 활성화 되는 탈인산화 과정을 억제함으로써 세포 자멸사로부터 세포를 보호하고, 조직 배양한 대뇌피질에서도 각 농도에 의존적으로 OGD 유도에 의한 hippocampus 세포 사멸 억제 효과를 있으며, 백서의 MCAO 모델에서도 효과적으로 경색의 범위를 감소를 확인할 수 있는 월계수 잎의 알코올 추출물과 클로로 포름 분획물을 함유하는 허혈성 신경계 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
4. 효과 및 응용
본 발명에 의한 월계수 잎의 알코올 추출물과 클로로포름 분획물을 함유하는 허혈성 신경계 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물은 월계수 알코올 추출물을 비롯한 핵산, 클로로포름 분획물 모두에서 OGD로 유도되는 뇌 신경세 포 사멸에 대한 억제효과가 있으며, 월계수의 알코올 추출물로부터 분획한 각각의 분획물에서 정도의 차이는 있지만 모두 그 효과를 발생함으로 월계수의 뇌 질환 관련 예방 및 치료로 사용할 수 있다.
또한, 월계수 분획물 중, 특히 클로로포름 분획물은 인간신경아세포종 SH-SY5Y 세포에서 OGD 로 유도되는 세포 사멸을 매우 효과적으로 감소시켰고, 더 나아가 흰쥐의 대뇌피질 세포에서 저산소, 저영양화로 유도되는 세포 사멸을 효과적으로 감소시키고 신경세포를 보호할 수 있으며, SH-SY5Y 세포에서는 약 50% 정도의 세포 사멸을 일으키는 환경에서도, 0.16 ㎍/㎖의 월계수 클로로포름과 핵산 분획물로도 뇌 세포 사멸의 보호효과를 있으며, 흰쥐의 조직을 이용하여 실험하여 월계수 클로로포름 분획물이 실제 뇌 허혈에서 가장 손상을 많이 받는 대뇌 피질 부분의 사멸을 효과적으로 억제함으로써, 세포를 이용한 in vitro 실험 결과를 뒷받침하고 동물을 이용한 in vivo 실험에서의 가능성을 제시할 수 있고, 월계수 클로로포름 분획물의 뇌 허혈로 인한 신경 세포 사멸 보 호 물질로써의 가능성이 있다.
또한, 세포를 이용한 실험에서 월계수 클로로포름 분획물은 death associated protein kinase (DAPK)의 탈인산 화를 억제하여 뇌세포 사멸을 줄여 이러한 DAPK가 뇌 허혈 환경에서도 탈인산화 되는 것을 억제하여 초기 세포 자멸사를 효과적으로 저해할 수 있으며, 이러한 결과로서 뇌 허혈 관련 세포 자멸사에서 DAPK가 중요한 조절 대상이 될 수 있으며 DAPK 의 활성 조절 물질이, 현재까지 특별한 치료제가 없는 뇌 허혈분야에서 새로운 치료 제로의 가능성이 있다.
또한, 월계수 클로로포름 분획물의 뇌허혈로 유도되는 동물실험에서 그 제반현상인 행동장애에 대해서도 탁월 한 치료 효과가 있어 인간 뇌 조직의 손상은 부위에 따라 행동장애, 언어장애, 인지장애, 기억장애 등등의 다 양한 형태로 나타날 수 있는 것을 감안할 때, 월계수 클로로포름 분획물이 직접적인 뇌 질환 뿐만 아니라 그 제반현상에 있어서도 예방과 치료 가능성을 도출할 수 있다.
또한, 월계수 클로로포름 분획물은 기존에 검증된 신경보호효과 물질인 카르노신과 비교할 때, 모든 실험에서 더 적은 농도에서 더 나은 효과를 발생함으로 월계수 클로로포름 분획물이 기존의 약물보다 더 강력한 신경보 호 치료 약물로써의 가능성이 있다.
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발명자: 이민규, 최승욱, 홍성관 대리인: 안태현
권 리 란
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표시번호 |
사 항 |
1번 |
출원 연월일 : |
2009년 05월 07일 |
출 원 번 호 : |
10-2009-0039627 |
특허결정(심결)연월일 : |
2011년 11월 30일 |
청구범위의 항수 : |
1 |
유 별 : |
A61K 36/54 |
발명의 명칭 : |
월계수 잎의 알코올 추출물과 클로로포름 분획물을 함유하는 허혈성 신경계 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물 |
존속기간(예정)만료일 : |
2029년 05월 07일 |
2012년 01월 26일 등록 | |
특 허 권 자 란
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순위번호 |
사 항 |
1번 |
(등록권리자) |
서울대학교산학협력단 |
서울특별시 관악구 관악로 * (신림동) |
2012년 01월 26일 등록 | |
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