본 발명의 개선된 ICSI 주입용 피펫 및 이를 이용한 ICSI 방법은 통상의 ICSI 방법이 가지는 문제점을 해소하여 훨씬 월등한 MPN 형성율과 배반포 발생율을 나타내는 등의 향상된 수정 성공율을 제공한다.

본 발명은 난세포질 내 정자 주입법(intracytoplasmic sperm injection, 이후 'ICSI'로 약칭함)에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 통상적인 ICSI 방법의 문제점들을 해결한 개선된 ICSI 방법 및 이것을 가능하게 하는 ICSI 주입용 피펫에 관한것이다.

ICSI는 정자를 난세포질 내로 인위적으로 주입하는 방법을 말하는 것으로, 웅성 인자 불임(male factor infertility)을 극복하기 위한 목적으로 또는 수정의 근본적인 메카니즘에 대한 연구 목적으로 사람을 포함하는 동물에서 광범위하게 사용되고 있는 방법이다.

ICSI가 처음으로 개발된 [Palermo et al., Lancet. 1992; 340: p17] 이래로, 이 방법을 사용하여 특

히 사람에게서 매우 높은 수준의 수정 성공에 이르게 되었다 [Hsu et al., Fertil. Steril. 1999; 72: p679].

ICSI는 특정 유형의 남성 불임을 극복하기 위한 매우 유효한 도구가 될 뿐만 아니라, 수정 과정에서 반드시 필요로 하는것과 그렇지 않은 것을 판단하여 연구하는데 유용한 수단이 되기도 한다 [Yanagimachi, In:Knobil E., Neill D (eds.), The Physiology of Reproduction, 2nd ed., New York: Raven Press, 1994, p189]. 더 나아가, ICSI는 정자-매개 유전자 전달(Sperm-mediated gene transfer, 이하 'SMGT'로 약칭함)의 유용한 도구로 사용되고 있다 (Smith KR, Anim.Biotechnol. 10, 1998, p 1; 미국 특허 제6,376,743호).

생체 내에서 일어나는 정상적인 체내 수정에서, 정자가 투명대(zona pellucida; 이하 'ZP'로 약칭함)에 결합한 후, ZP를투과하고 난막(oolemma)과 융합하는데 필요한 세포성 외포작용(exocytosis)의 한 형태인 첨체 반응(acrosomereaction)이 일어난다.

실질적인 융합 부위는 생체 내 조건에서 난막과 통합되는 정자 두부(sperm head)의 첨체 뒷부분

영역(postacrosome region)이다.

제 2 극체가 돌출된 후 모계 염색체는 응축되어 자성 전핵(female pronucleus, 이하'FPN'이라 약칭함)을 형성한다. 배우체(gamete) 막 융합은 첨체 뒷부분 영역 절편의 전면 반쪽을 따라 일어나는 반면, 정자 두부는 외피 원형질(cortical plasma)의 설형 과정(tongue-like process)에 의해 함입된 후 식세포작용(phagocytosis)으로 도입된다.

단정자 수정에 있어서, 정자는 두부가 먼저 도입되고 꼬리는 일반적으로 지퍼형 방식(zipper-like fashion)으로 도입된다 [Sathananthan A.H. In: Handbook of in Vitro Fertilization. Trounso A. GardnerD.K. (eds). Boca raton, FL: CRC, p237]. 실제로, 유대 포유류(eutherian mammal)에서 첨체의 적도부(equatorialsegment) 상부의 정자 세포막은 난세포막(oolemma)과 우선적으로 융합되고 [Bredford et al. In: Poste G., NicolsonG.L., eds. Membrane Surface Reviews (Membrane fusion), Amsterdam: North-Holland. 5, 1978, p65] 융합 후, 일반적으로 정자 두부가 함입된 후 전체 꼬리가 난세포질 내로 도입된다.

위와 같은 정상적인 수정 메커니즘을 밝혀냄으로써 이러한 과정을 모사한 보조생식기술의 연구가 활발하게 진행되었는데, 그 중의 하나가 ICSI 방법이다.

즉, ICSI는 위와 같은 정자와 난막의 인식, 결합, 투과 및 융합 과정을 우회하여 이러한과정을 인위적으로 이루어지게 한 것이다.

위와 같이 생체에서의 정상적인 수정 과정을 모사하는 통상적인 ICSI 방법은 일반적으로 정자 꼬리를 손상시키는 과정(스코링(scoring)), 정자를 주입용 피펫(injection pipette) 내로 완전히 흡입하여 포획하는 과정 및 정자와 함께 난세포질성 물질들을 주입 피펫 내로 흡입하여 주입 정자와 난세포질을 혼합한 뒤 다시 난세포질 내로 주입하는 과정으로 이루어져있다.

또한, 이러한 통상적인 ICSI 방법에서 수정율을 향상시키기 위한 연구가 계속되어 오고 있는데, 주로 정자에 운동성을 부여하는 꼬리 및 꼬리 막(tail membrane)을 적절히 처리하는 것을 중심으로 개선되어 왔다.

즉, 운동성 있는 정자의 조작에서의 용이성과 난세포 활성을 유도하는 가용성 정자 내 물질의 방출을 위해서 정자의 고정화(immobilization)와 세포막의파괴는 성공적인 수정을 위해 필요한 것으로 여겨져 오고 있다 [Svalander et al., Fertil. Steril. 1995; 63: p828;Vanderzwalmen et al., Hum. Reprod. 1996; 11: p540; 및 Dozortsev et al., Hum. Reprod. 1997; 12: p2792]. 즉, 주입용 피펫이 정자 꼬리에 기계적인 손상을 주는 경우, 이의 세포막은 파괴되고 이로써 정자 두부 탈응축을 유도하는 난자내 세포질성 인자들이 정자 내로 도입될 수 있게 된다[Flaherty et al., Reprod. Fertil. Dev. 1995; 7: p197].

이러한 통상적인 ICSI 방법에서 운동성 있는 정자의 고정화와 정자꼬리 세포막 손상을 위해 정자 꼬리를 물리적으로 절단하거나 제거 또는 충격을 주는 방법, 피에조(piezo) 펄스 충격, 흡입 및 흡출의 반복 등의 방법을 동원해 왔다.

또한, 많은연구자들은 위와 같은 조작을 위해 정자의 운동성을 떨어뜨려야 했고, 이를 위해서 그 효과상의 불리한 점에도 불구하고정자의 운동성을 떨어뜨리는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone, 이하 'PVP'라 약칭함)을 사용해 오고 있다.

PVP용액의 점성은 정자의 운동성을 극적으로 감소시키며 주입용 피펫 외부 및 내부로의 유체의 이동을 조절하는 것을 개선시키기 때문에 최근까지 통상적으로 PVP를 사용해 오고 있으며, 대부분의 연구자들은 PVP의 사용을 ICSI의 성공에 중요한 인자로 생각해 오고 있다.

또한, 통상적인 ICSI 방법에서 사용되는 주입용 피펫은 피펫 내부 및 외부로 정자가 이동하는데 어려움이 없는 정도의 충분한 직경을 가져야 하므로 조작하는 정자 두부의 직경보다 필연적으로 더 클 수 밖에 없다.

하지만, 주입용 피펫의 직경이8㎛ 보다 넓은 경우에는 주입하는 동안 난자의 세포질이 너무 많이 파괴되는 문제점을 안고 있다[Payne D., Reprod.Fertil. Dev. 1995; 7: p185].

이상과 같이, 정자를 난세포질 내로 주입하는 보조생식기술 중 하나인 ICSI 방법은 1992년 최초로 개발된 이래 높은 수정율을 나타내며, 사람의 불임 시술에서 광범위하게 활용되고 있지만, 정자의 운동성이 미세조작 속도를 능가하기 때문에 정자의 주입을 위해서는 정자의 운동성을 떨어뜨려야 할 필요가 있었으며, 정자 주입 전에 주입용 피펫으로부터 벗어나는것을 방지하기 위해 정자 꼬리를 무력화시켜야 했다.

또한, 주입된 정자의 난세포질 내에서 탈응축을 유도하고 함께 유입되는 배지의 양을 극소화시키기 위기 위해 정자 꼬리의 원형질 막을 손상시키거나 꼬리를 자르는 것이 불가피하였다.

위와 같이 통상적인 ICSI 방법에서의 PVP 사용, 꼬리 스코링, 꼬리 절단 등의 조작은 정상적인 수정 환경과 차이가 나게하였으며, 주입용 피펫의 직경이 정자의 외경보다 더 큼으로 인한 PVP를 포함한 배지의 주입량이 많아지고, 난세포의 파괴가 일어나는 단점이 있어 왔다.

이미 밝혀진 연구 결과에 의하면 지금까지의 ICSI 방법을 통한 수정란의 생존율이 낮은 것은 주입 피펫의 크기가 너무 크기 때문임을 들고 있다 (Dozortsev et al., Zygote. 1998; 6: p143). 또한, 과다한 배지의사용은 정자 두부 막을 둘러싸기 때문에 정자 두부의 세포질 내 물질과의 접촉을 방해하게 됨을 밝히고 있다 (Hsu et al.,Fertil. Steril. 1999; 72: p679).

특히, 정상적인 수정의 경우 정자의 두부가 융합과 탈응축이 일어나는 부위임에도 불구하고 통상적인 ICSI 방법에서는꼬리 막의 손상에만 관심을 집중해 온 한계가 있었다.

이에 본 발명자는 지금까지의 ICSI 방법이 가지는 위와 같은 문제점을 해소하여 수정율을 향상시킬 수 있는 새로운 접근방법을 시도하여 그 성과를 밝힘으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

위와 같은 통상적인 ICSI 방법이 가지는 문제점을 해소하고 수정율을 향상시키기 위해 본 발명은 개선된 ICSI 주입용 피펫과 이를 사용한 새로운 ICSI 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉, 정상적인 수정 과정에 더 근접한 새로운 ICSI 방법을 제공하고자 한다.

구체적으로, 본 발명은 정자 두부 막(sperm head membrane)에 기계적인 손상을 유발하는 주입용 피펫과 이를 적용한ICSI 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

특허 기술 설명

본 발명의 개선된 ICSI 방법은 본 발명의 특징적인 주입용 피펫을 사용하여 수행될 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 난자 내로 주입하고자 하는 정자 두부의 최대 직경보다 크지 않은 내경을 가지고, 팁의 말단에 다수의 작은 스파이크를 부가한 주입용 피펫을 형성하여, 주입용 피펫의 팁(tip)에 정자를 포획한 뒤 난세포질 내로 주입하고, 난세포질 내에서 세포질 물질과 혼합한 후 주입 피펫을 회수하는 과정으로 이루어진다.

이하, 본 발명의 구성에 대하여 구체적으로 설명한다.

주입용 피펫 (injection pipette)

본 발명의 주입용 피펫은 통상적인 ICSI에 사용되는 것과 같이, 양단이 열린(open) 모세관을 가공하여 사용할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 사용되는 주입용 피펫은 난자 내로 주입하고자 하는 정자를 주입용 피펫의 팁에 포획할 수 있는 정도의 내경을 가지도록 구성된다. 또한, 본 발명의 주입용 피펫의 정자를 포획하는 팁은 그 말단에 다수의 짧고 작은 스파이크가 형성될 수 있다.

보다 구체적으로는 도 3에서 보는 바와 같이, 주입용 피펫의 내경은 조작하고자 하는 정자 두부의 최대 직경보다 크지 않으며, 이로 인해 정자가 주입 피펫 안으로 완전히 들어가지 못하고 피펫의 팁에 포획되도록 한다. 특히, 본 발명의 주입용피펫의 내경은 정자 두부의 적도 영역(equatorial region)이 주입용 피펫의 팁에 부착되는 정도가 바람직하다.

도3)

한편, 다른 일단은 개방(open-end)되도록 형성되는데, 이로써 주입용 피펫 내부가 모세관 현상으로 음압(negativepressure)이 발생하게 된다.

이는 운동성의 정자의 포획을 용이하게 한다.

본 발명의 주입용 피펫은 모세관을 이용하여 제작될 수 있는데, 구체적으로는 원하는 정도의 내경이 나올 수 있는 모세관을 길게 뽑아내어 주입용 피펫의 팁으로부터 약 1mm 지점을 원하는 각도로 구부린 후 정자의 주입 직전 난자의 소적(drop) 내에서 제작할 수 있다.

도1)

즉, 가늘게 뽑아진 모세관을 홀딩 피펫의 개구 내로 삽입하여

(도1, A)

원하는 직경을 가지는 지점에서 피펫을 구부려 부러뜨려 주입용 피펫의 팁의 개구부를 형성한다.
(도1, B,C)

그 후, 홀딩 피펫 내의 부러진 모세관 조각은 폐기된다.

이러한 본 발명의 주입 피펫의 제작방법은 주입 피펫의 팁의 말단에 다수의 작은 스파이크를

형성하게 할 수 있다.

본 발명에 있어서 주입용 피펫의 위와 같은 구성은 정자 포획과 정자 주입에 있어서 많은 이점을 제공하게 된다.

주입용피펫 자체가 가지는 음압으로 인해 정자의 포획을 용이하게 할 수 있는데, 정자의 운동성을 떨어뜨리기 위한 PVP와 같은별도의 화학물질의 사용을 필요로 하지 않게 된다.

또한, 정자를 주입용 피펫의 내부에 완전히 들어가지 않고 피펫 팁에 부착되도록 하는 직경을 가짐으로써 정자 전체의흡입과 흡출이 가능한 큰 직경을 가진 통상적인 ICSI 방법에 사용되는 주입 피펫보다 그 크기가 작아 난세포질의 파괴를줄임과 동시에 정자와 함께 유입되어 난세포질 내로 들어가는 배지의 양을 줄일 수 있다.

또한, 유입되는 배지 양을 감소하기 위해 정자의 꼬리를 절단하지 않아도 되는데, 이로 인해 본 발명의 ICSI 방법은 체내에서 일어나는 정상적인 정자 유입과 유사한 환경을 제공하게 된다.

또한, 주입 피펫 팁 말단의 다수의 스파이크는 정자 두부 막의 손상과 난세포질막의 통과를 용이하게 할 수 있다.

특히, 본 발명의 ICSI 주입용 피펫은 그 직경을 적절하게 변경함으로써 특정 종(species)의 정자의 조작 또는 포획에 제한되지 않고 광범위하게 사용될 수 있다.

본 발명의 ICSI 방법

본 발명의 개선된 ICSI 방법은 위 주입용 피펫을 사용하는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 개선된 ICSI 방법은 본 발명의 특징적인 주입용 피펫을 이용하여 온전한 운동성을 가진 정자를 주입용 피펫의 팁에 포획하여 세포질 내로 주입한 후 주입용 피펫을 회수하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명의 방법은 주입된 정자와 난세포질을 혼합(mingling)하는 과정을 더 포함할 수 있다.

정자의 포획

본 발명에서 정자의 포획은 본 발명의 주입용 피펫을 운동성 있는 정자의 미부 또는 두부 가까이로 이동시킴으로써 가능하다.

또는, 운동성 있는 정자가 주입용 피펫에 근접하는 경우에도 가능하다. 더 바람직하게는 도립 현미경 및 미세조작기하에서 운동성 있는 정자와 주입용 피펫을 근접시킴으로써 정자의 포획이 가능하다.

위와 같이 정자의 운동성을 떨어뜨리지 않고 정자를 용이하게 포획할 수 있는 것은 모세관 현상으로 인해 음압이 발생하는 본 발명의 주입용 피펫의 특징 때문이다.

본 발명에서는 정자의 움직임이 아무리 빨라도 용이하게 포획되는데, 주입용 피펫을 소적 경계부 주위를 빠르게 유영하는 정자의 꼬리 근처에 접근시키면 정자 두부의 적도 영역이 주입 피펫의 팁에 끼일 때까지 쉽게 흡입될 수 있다.

주입용 피펫의 음압으로 인한 정자의 포획에 있어서 주입용 피펫에 정자의 두부가 먼저 이끌려 와서(head-first) 포획되거나 미부가 먼저 이끌려 와서 (tail-first) 포획될 수 있다.

난세포질 내 정자 주입

위와 같이 주입용 피펫의 팁에 포획된 정자는 본 발명의 ICSI 방법으로 난세포질 내로 주입될 수 있다.

즉, 포획된 정자는주입용 피펫과 함께 직접 난세포질 내로 주입된다. 구체적으로 정자의 주입은 도 5에서 보는 바와 같이, 난자를 고정하고있는 홀딩용 피펫과 정자를 포획한 주입용 피펫을 나란하게 하여 난자의 뒤틀림이 없도록 하여 수행될 수 있다.

특히, 본발명의 주입 피펫 팁의 말단에 형성된 다수의 스파이크는 난세포질막을 용이하게 통과하는 것을 가능하게 한다.

주입용 피펫으로 정자를 난세포질 내로 주입한 후에, 입으로 압력을 조절해서 주입용 피펫에 음압과 양압(positivepressure)을 순차적으로 가하여 줌으로써 주입용 피펫과 정자를 분리시킬 수 있다.

위와 같이 양압과 음압을 순차적으로 제공하여 정자를 난세포질과 혼합(mingling)시킨다. 바람직하게는, 현미경을 통해보면서 입으로 불었다 빨았다하는 방식으로 압력을 조절하여 2~3회 반복하여 정자를 난세포질과 혼합시킬 수 있다.

이렇게 세포질 물질과 혼합된 정자는 주입용 피펫을 난세포질로부터 회수함으로써 주입용 피펫과 분리되어 정자만이 난세포질 내에 남게 할 수 있는데, 이는 난세포질 내의 점성으로 인해 정자가 주입용 피펫을 따라 난세포질이 밖으로 나오는것이 방지되기 때문이다.

이와 같이, 포획된 정자의 난세포질 내로의 직접 주입은 ZP와 난막을 통과하는 동안의 정자 두부 막의 기계적인 손상과 더불어 완성되고, 세포질내에서 피펫내 음압과 양압을 입(mouth)으로 적절히 조절하여 세포질내로의 과도한 배지와 주입용 피펫내로의 과도한 세포질 물질의 유입없이 손상된 정자 두부와 세포질 물질과의 혼합을 완성할 수 있다.

정자 두부 막 손상

본 발명의 위와 같은 정자의 주입 방법은 특징적으로 정자 두부의 손상을 일으키게 한다. 즉, 운동성 있는 정자가 주입 피펫의 날카로운 팁에 포획되는 경우 두부 막에 미세하게 기계적인 손상을 입게 되며, 또한 도 3 및 5 에서 보는 바와 같이,주입용 피펫과 함게 ZP 및 난세포막을 통과하면서 정자 두부 막에 더 많은 손상을 입게 될 수 있다.

도3)

도5)

이는 체내에서의 정상적인 수정의 과정과 유사한 조건을 제공하게 되어, 난세포 활성을 유도하는 정자 내 물질을 방출하여 수정율을 향상시킬 수 있게 한다. 통상적인 ICSI 방법의 사용에서도 정자 꼬리에의 기계적인 손상이 심하면
심할수록수정율이 향상된다는 사실(Palermo et al., Hum Reprod. 1996; 11: p1023)로부터 본 발명의 수정율 향상의 근거가 될 수있다.

위와 같이, 본 발명의 주입용 피펫은 그 음압으로 인해 운동성 있는 정자의 포획이 용이하여 주입기 및 PVP와 같은 화학물질을 사용할 필요가 없어 정상적인 수정 환경과 더 근접하게 할 수 있으며, 통상적인 ICSI 방법에 사용되는 주입용 피펫보다 그 직경이 줄어들게 되어 난세포질의 손상을 줄이고, 난세포질 내로 주입되는 배양액 등의 이물질의 양을 감소시키는 이점을 제공할 수 있다.

특히, 정자의 주입 과정에서 정자의 두부 막의 기계적인 손상을 유발시킴으로써 수정율을 향상시킬 수 있다.

발명자: 황우석, 이병천, 강성근, 용환율, 현상환,

대리인: 이세진, 김성남