본 발명에 따른 방법은 복제늑대를 생산하는 효과가 있으며, 이는 희귀·멸종 위기의 늑대의 보존, 이종이식, 질환 모델동물 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할수 있다.

본 발명은 복제늑대의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 개과 동물의 난자로부터핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조한 다음 늑대의 체세포를 공여 핵 세포로 이용하여 상기 탈핵 난자에 이식하고최적화된 조건으로 융합시켜 핵 이식란을 제조한 다음 이를 대리모의 난관에 이식하는 것을 특징으로 하는 복제늑대의 생산방법에 관한 것이다.

최근 세포융합 또는 세포 직접주입에 의한 체세포 핵 이식 기술이 발전되면서 복제동물의 생산이 본격적으로 이루어지고 있다.

체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.

일반적으로 체세포 핵이식 기술에서 체세포 공여 핵을 이식할 수핵 난자(recipient oocyte)는 인위적으로 시험관 내(invitro)에서 배양하여 2차 감수분열 중기까지 도달하도록 성숙시켜 사용한다.

그 다음 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상 발생을 방지하기 위하여 체세포를 이식하기 전에 상기 성숙 난자의 핵을 제거하고 상기 탈핵 난자의 주란강 또는 세포질 내에 체세포를 주입한다. 그 후 상기 탈핵 난자와 주란강 또는 세포질에 주입된 체세포를전기적 자극을 통하여 물리적으로 융합시키고 전기자극 또는 화학물질에 의하여 활성화시킨 후 대리모에 이식하여 산자를 탄생시킨다.

이러한 체세포 핵이식 기술은 우량 동물의 번식, 희귀·멸종위기 동물의 보존, 특정영양물질의 생산,치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포·유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수있다.

체세포 핵이식을 통한 동물복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다.

이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및US5,945,577).

한편, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어 개 또는 다른 애완동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다. 최근 애완동물로는 처음으로 고양이가 복제되었으며 수백만 달러의 기금으로 개 복제의 연구가 수행되기도 하였다.

한편, 성체 양이 동결된 체세포로부터 복제되었다는 보고는 복제 기술이 멸종 위기의 종 (species)의수를 증가시키거나 멸종위기로부터 벗어나게 하는데 적용될 수 있음을 올리게 하였다 (J. Cohen, Science 276,1329 (1997)).

하지만, 설치류의 복제나 가축의 복제와는 달리 난자의 부족으로 인해 멸종위기의 종의 복제는 속간 (屬間, intrageneric) 또는 이종간 체세포 핵 이식 (SCNT)와 같은 대안이 필요할 것이다.

속간 SCNT는 최근 몇몇 멸종 위기의 종들에게 적용된 바 있다. 인도산 들소 (Bos gaurus) 체세포가 탈핵된 일반 소 (Bostaurus)와 융합되어 비록 생후 2일 만에 죽었지만 산자 (offspring)가 태어난 바 있다 (G. Vogel, Science291, 5503 (2001).

양의 난자에 핵 이식되어 발달된 멸종 위기의 양인 아르갈리 (argali) 수정란을 생산한 바 있으며 (K.L. White et al., Cloning Stem Cells 1, 47 (1999). 또한, 동일한 방법을 사용하여 무플런양(mouflon lamb)이 태어났다 (P. Loi et al., Nat. Biotechnol. 19, 962 (2001).

회색 늑대 (Canis lupus)는 한국을 포함한 많은 나라에서 멸종위기의 동물로 여겨지고 있다.

한국에서, 회색 늑대는 야생에서 거의 발견되지 않으며 적은 수만이 특정의 동물원에서 사육되고 있다.

최근에, 체세포 복제기술이 확립되어감에 따라 늑대 및 들개 (Dingo)를 포함하는 멸종 위기의 개과동물을 보존하는데 SCNT의 적용가능성을 높이게 되었다.

이에 본 발명자들은 체세포 핵이식 방법에 의한 복제늑대의 생산방법을 연구하던 중 개과 동물의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조한 다음 늑대의 체세포를 공여 핵 세포로 이용하여 상기 탈핵 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 제조하고 이를 대리모의 난관에 이식함으로써 최초로 체세포 핵이식 방법에 의해 복제된 늑대를 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

특허 기술 설명

본 발명에서 '개과 동물'로는 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리가 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다.

본 발명은, 체세포 핵 이식 기술을 사용한 복제 시 핵 이식란의 전기융합 조건과 활성화 조건을 최적화하여 늑대의 핵 이식란을 제조하고, 상기 핵 이식란을 개과 동물의 대리모 난관에 이식하여 산자를 생산함으로써 최초로 늑대의 복제를 수행하였다는 데에 특징이 있다.

구체적으로, 본 발명의 늑대의 핵 이식란 생산방법은

1.개과 동물의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;

2.늑대의 조직으로부터 체세포를 분리하여 공여 핵 세포를 제조하는 단계;

3.상기 (1) 단계의 탈핵 난자에 (2) 단계의 공여 핵 세포를 미세주입하고 전기 융합시키는 단계; 및

상기 (3) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 늑대의 핵 이식란 생산방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

제1단계: 수핵 난자의 탈핵

수핵 난자는 개과 동물에서 회수된 미성숙 난자를 체외에서 성숙시켜 이용하거나 개과 동물의 체내에서성숙된 난자를 회수하여 이용할 수 있다.

일반적으로 포유동물 (예컨대 소, 돼지, 양 등)의 난자는 성숙난자,즉 제2차 감수분열 중기 (metaphase Ⅱ)에 배란되는 것에 반해, 개과 동물의 난자는 다른 동물과는 달리 제1차감수분열의 전기에 배란되어 난관 내에서 48∼72시간 동안 머물면서 성숙되는 특징이 있다.

개과 동물의 난자의 핵 성숙률이 매우 낮고, 배란시기 및 번식 생리가 다른 포유동물과는 달라서 개과 동물의 수핵난자는 개과동물의 생체 내에서 성숙된 난자를 회수하는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로 개과 동물로부터 성숙 난자의 회수는 개과 동물의 배란이 유도된 후 약 48∼72시간째,보다 바람직하게는 72시간째에 수행하는 것이 바람직하다.

상기에서 개과 동물의 배란일은 당 업계에 공지된방법을 사용하여 결정할 수 있다.

배란일을 결정하는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 질세포도말검사 (vaginal smear), 혈장 성 호르몬 수준 측정 및 초음파 진단 시스템을 사용할 수 있다.

개과 동물의발정의 시작은 외음부 팽창 및 장액성 혈액의 배출 여부를 통해 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 개과 동물의 배란일을 질세포 도말검사와 혈장 프로게스테론 농도 검사를수행함으로써 무각화 상피 세포가 80% 이상이고 혈장 프로게스테론 농도가 약 4.0~7.5 ng/mL일 때를 배란일로간주하여 배란 후 48∼72시간, 바람직하게는 배란 후 약 72시간째에 난자를 회수하였다.

한편, 배란된 개과 동물의 난자의 성숙 시기는 배란 후 48∼72시간으로 알려져 있으며 본 발명자들은 배란 후 48시간째, 60시간째 및 72시간째에 난자를 회수하여 확인해 본 결과, 배란 후 약 72시간째 회수된 난자가 제2차 감수분열 중기(metaphase Ⅱ)에 해당하는 성숙 난자임을 확인할 수 있었다.

따라서 개과 동물의 성숙 난자의 회수는 배란 후 약 72시간째가 가장 바람직함을 알 수 있었다.

생체 내 성숙 난자를 회수하는 방법으로는 대상 동물을 마취한 후 개복시키는 것을 포함하는 외과적 방법을 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 생체 내 성숙 난자의 회수는 당업계에 공지된 방법인 난관 절제법을 사용할 수 있다.

상기 난관 절제법은 난관을 수술적으로 잘라낸 후 배아 수집 배지를 난관 내부에 관류시켜 관류액을 수득하고 상기 관류액으로부터 난자를 회수하는 방법이다.

또한, 생체 내 성숙 난자는 카테터를 난관채에 장착한 후 난관-자궁 접합부위에 주사침을 이용하여 관류액을 주입함으로써 회수할 수 있다.

이 방법은 난관을 손상시키지 않기 때문에 난자를 공여하는 동물을 다음 발정에도 이용할 수 있는 장점이 있다.

따라서 바람직하게는 생체 내 성숙 난자의 회수는 난관을 손상시키지 않는 카테터를 이용한 방법을 사용한다.

한편, 본 발명자들은 카테터를 이용한 난자 회수 방법에 있어서 회수율을 높이기 위해 니들의 앞부분이 둥글게 처리되어 있어 난관 입구에 장착이 용이한 난자 회수용 니들을 새롭게 개발하였다 (대한민국 특허출원 제10-2005-0067736호).

보다 구체적으로, 본 발명자들이 개발한 니들을 이용한 난자 회수방법은 앞부분이 둥글게 처리된 난자 회수용 니들을 난관 내에 삽입-결찰한 후 난관-자궁 접합부에 난자 회수용 배지를 관류시켜상기 난자 회수용 니들에 관류액이 유입되도록 하고 상기 관류액을 현미경으로 검경하여 성숙한 난자를 수득하는 방법이다

본 발명에서 상기 개과 동물 유래의 난자는 바람직하게는 개로부터 수득할 수 있다. 이는 현실적으로 늑대의 난자를 다량으로 수득하는 것이 어렵기 때문이다. 한편 개의 경우 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있다.

이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066).

성숙한 난자를 회수한 다음에는 난자의 반수체 핵을 제거한다. 난자의 탈핵은 당업계에 공지된 방법을사용하여 수행할 수 있다 (미국특허 제4994384호, 미국특허 제5057420호, 미국특허제5945577호, 유럽특허 공개공보 제0930009A1, 대한민국특허 제342437호, Kanda et al, J. Vet. Med. Sci., 57(4):641-646, 1995;Willadsen, Nature, 320:63-65, 1986, Nagashima et al., Mol. Reprod. Dev. 48:339-343 1997; Nagashima etal., J. Reprod Dev 38:37-78, 1992; Prather et al., Biol. Reprod 41:414-418, 1989, Prather et al., J.Exp. Zool. 255:355-358, 1990; Saito et al., Assis Reprod Tech Andro, 259:257-266, 1992; Terlouw etal., Theriogenology 37:309, 1992).

바람직하게는, 수핵난자의 탈핵은 크게 두 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

한 가지 방법으로는 성숙한 수핵난자의 난구 세포 (cumulus cell) 를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵난자의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고 이를 통하여 제1극체, 난자의 핵 및 세포질 (가능한 적은 양)을 제거한다.

다른 방법으로는 수핵난자의 난구 세포를 제거한 다음 난자를 염색하고 미세 흡입 피펫 (aspiration pipet) 을 이용하여 제1극체 및 난자의 핵을 제거한다. 보다 바람직하게는, 난자의 탈핵은 수핵난자의 상태를 육안으로 평가하여 생존율이 높은 난자에 대해서 흡입 방법을 사용하고, 그렇지 않은 난자에 대해서는 절개창을 형성하는 방법을 사용한다.

제2단계: 공여 핵 세포의 제조

공여 핵 세포로는 늑대로부터 유래된 체세포가 사용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 사용된 체세포로는 개과 동물의 배아세포 (embryonic cell), 태아세포 (fetus cell), 유세포 (juvenile cell), 성체세포(adult cell), 바람직하게는 성체세포로부터 수득될 수 있는 난구, 피부, 구강 점막, 혈액, 골수, 간, 폐,신장, 근육 및 생식기관 등과 같은 형태의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포,멜라닌 세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아생식세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 체세포로는 태아 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다.

또한, 본 발명의 공여 핵 세포는 난자와는 다른 개체에서 유래할 수 있다.

나아가, 본 발명에서 사용되는 공여 핵 세포는 상기 야생형 체세포에 특정 유전자를 삽입하거나 조작하여 염색체를 유전자 이식방법이나 유전자 적중법을 이용하여 형질전환시킨 것일 수 있다.

상기 유전자 이식방 법이나 유전자 적중법은 당업계에 공지된 방법이므로 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.

공여 핵 세포로서 제공되는 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 상기 표본으로부터 공지된 방법을 사용하여 단일세포를 수득할 수 있다.

예를 들면, 대상동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 조직 배양용 배지에서 배양한다.

조직 배양용 배지에서 3∼4일 배양 후에 배양접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 완전히 다 자라면 일부는 추후 사용을 위하여 동결하여 액체 질소에 보관하며, 나머지는 핵 이식에 이용하기 위하여 계속 배양을 실시한다. 계속하여 배양하여 핵이식에 사용할 세포는 10번 계대 배양 이하를 전제로 하여 세포가 과도하게 커지는 것을 방지한다.

상기에서 조직 배양용 배지로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면, TCM-199,

DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이 있다.

제3단계: 공여 핵 세포의 미세주입 및 융합

탈핵 난자에 공여 핵 세포의 미세주입은 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입함으로써 수행한다.

상기에서 공여 핵 세포의 미세주입이 완료된 탈핵 난자는 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 공여 핵세포와 융합시킨다.

전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있으며, 바람직하게는 전압 3.6∼4.1 kV/cm조건으로 수행할 수 있으며 보다 바람직하게는 직류 전압 3.6∼4.1 kV/cm 조건으로 10∼30㎲ 동안 1∼3회 수행할 수 있다.

가장 바람직하게는, 직류 전압 3.6∼4.1 kV/cm 조건으로 20㎲ 동안 2회 수행할 수 있다.

상기에서 전압이 3.6 kV/cm 미만이거나 또는 4.1 kV/cm을 초과하는 경우에는 매우 낮은 융합율을 보인다.

상기 전기적 융합시의 전압 범위는 지금까지 알려진 일반적인 전기적 융합시의 전압 범위(1.7∼2.0 kv/cm) 보다 높은 특징이 있다.

반면, 본 발명의 발명자들이 수행한 복제 견의 생산에 있어서, 전기융합시 최적 전압 범위를 결정하기위하여 공여 핵 세포를 미세주입한 핵 이식란을 각기 다른 전압 범위에서 전기적으로 융합한 다음 현미경으로검경하여 융합율을 조사한 결과, 전압 범위가 3.0∼3.5 kV/cm인 경우 융합율이 75.2%로 가장 높게 나타남을 알수 있었다 (대한민국 특허출원 제10-2005-000067736호 참조).

공여 핵 세포와 난자의 전기적 자극에 의한 융합은 융합용 배지 내에서 수행할 수 있다. 상기 융합용배지로는 만니톨, MgSO4, 헤페스, BSA가 혼합된 배지를 사용할 수 있다.

제4단계: 융합된 핵 이식란의 활성화

융합된 핵 이식란의 활성화는 성숙과정에서 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키는 단계이다.

이를 위해서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키타제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시켜야 한다.

일반적으로 핵 이식란을 활성화하는 방법은 전기적 방법 및 화학적 방법이 있다. 본 발명에서는 핵 이식란의 활성화를 위한 방법으로 화학적 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 화학적 방법은 전기적 활성화 방법에비해 본 발명에 따른 핵 이식란의 활성화를 보다 많이 촉진할 수 있다.

상기에서 화학적 방법으로는 에탄올,이노시톨 트리포스페이트, 2가 이온 (예를 들어 Ca2+또는 Sr2+), 미소관 억제제 (microtubule inhibitors, 예를 들어 사이토칼라신 B), 2가 이온이오노포어 (ionophore) (예를 들어, Ca2+이오노포어 이노마이신), 단백질 키나제 억제제 (예를 들어, 6-디메틸아미노퓨린), 단백질 합성 억제제 (예를 들어, 사이클로헥시미드,퓨로마이신), 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate)와 같은 물질을 처리하는 방법이 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 핵 이식란의 활성화를 위한 화학적 방법으로는 칼슘 이오노포어와 6-디메틸 아미노퓨린을 핵 이식란에 동시에 처리하거나 단계적으로 처리하는 방법을 사용할 수 있다.

보다 바람직하게는 칼슘 이오노포어 5∼10μM을 37~39℃에서 3∼6분 동안 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린 1.5mM∼2.5mM을 37∼39℃에서 4∼5시간 동안 처리한다.

본 발명의 발명자들은 상기 핵 이식란을 전기적 방법과 화학적 방법으로 각각 활성화한 후 핵 이식란의 발육정도를 측정한 결과, 핵 이식란의 활성에 있어서 화학적 방법이 전기적 방법에 비해 보다 더 우수함을 확인할 수 있었으며, 화학적 방법에 의해 핵 이식란을 활성화함으로써 상실배기까지 발육시킬 수 있음을 확인하였다(대한민국 특허출원 제10-2005-000067736호 참조).

다른 관점으로, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 늑대의 핵 이식란을 제공한다.

본 발명자들은 본발명의 일 실시예에서 제조한 늑대의 핵 이식란을 SNU-WOLF (Cloned wolf Embryos)라 명명하고, 2006년 1월 24일자로 한국생명공학연구원 유전자은행 (KCTC, 대전 광역시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 KCTC 10903BP로 기탁하였다.

상기 핵 이식란은 동결 보존한 후 필요한 때에 이를 용해시켜 사용할 수 있다.

더 나아가, 본 발명에 따른 늑대의 핵 이식란은 대리모에 이식되어 산자를 출생시킴으로써 복제된 늑대를 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵 이식란의 대리모 이식은 대리모의 난관에 이식을 수행한다.

이식은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며 바람직하게는 카테터를 사용하여

복제 배아를 이식할 수 있다.

발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식함으로써 복제 늑대SNUWOLF 및 SNUWOLFFY를 처음으로 각각 생산하였다.

그러나 본 발명에 따른 핵 이식란을 대리모의 자궁에 이식한 경우에는 임신되지 않음을 확인하였다. 따라서 복제 늑대의 생산에 있어서 핵 이식란의 이식은 대리모의 난관에 수행하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

또한, 핵 이식란의 이식은 핵 이식란 제조 후 4시간 이내에 수행하는 것이 바람직하다.

개과 동물의 경우, 복제 배아의 배양이 어렵기 때문에 가능한 빨리 활성화된 복제 배아를 이식하는 것이 바람직하며, 또한, 핵이식란의 활성화 후 바로 이식하는 것이 바람직하다.

한편, 상기 대리모 이식에 있어서 상기 핵 이식란은 1세포기 (바로 만들어진 복제란)이거나 2 세포기또는 4 세포기의 것일 수 있다. 또한 상기 핵 이식란은 대리모가 준비되기 전까지 미네랄 오일이 덮여진 mSOF25㎕ 미세유적(microdrop)에서 배양할 수 있다.

상기 본 발명의 방법에 의해 생산된 복제늑대는 공여 핵 세포 또는 공여체와 완전히 동일한 유전적 특성을 갖는다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 방법에 따라 복제견 및 복제 늑대를 생산하고 이의 유전적 특성을 마이크로세틀라이트 분석방법을 이용하여 분석한 결과, 본 발명에 따른 복제 늑대는 공여 핵 세포 또는 공여체와 완전히 동일한 유전적 특성을 가짐을 확인할 수 있었다

발명자:황우석, 이병천, 김성근, 김민규, 장구, 오현주, 유다 헤루, 김혜진, 김정주, 신남식, 후세인 샤밍

대리인: 김순웅